分子克隆名词解释(分子克隆)
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1、(1)DNA片段的制备:常用以下方法获得DNA片段:①用限制性核酸内切酶将高分子量DNA切成一定大小的DNA片段;②用物理方法(如超声波)取得DNA随机片段;③在已知蛋白质的氨基酸顺序情况下,用人工方法合成对应的基因片段;④从mRNA反转录产生cDNA。
2、 (2)载体DNA的选择: ①质粒:质粒是细菌染色体外遗传因子,DNA呈环状,大小为1-200千碱基对(kb)。
3、在细胞中以游离超螺旋状存在,很容易制备。
4、质粒DNA可通过转化引入寄主菌。
5、在细胞中有两种状态,一是“紧密型”;二是“松弛型”。
6、此外还应具有分子量小,易转化,有一至多个选择标记的特点。
7、质粒型载体一般只能携带10kb以下的DNA片段,适用于构建原核生物基因文库,cDNA库和次级克隆。
8、 ②噬菌体DNA:常用的λ噬菌体的DNA是双链,长约49kb,约含50个基因,其中50%的基因对噬菌体的生长和裂解寄主菌是必需的,分布在噬菌体DNA两端。
9、中间是非必需区,进行改造后组建一系列具有不同特点的载体分子。
10、λ载体系统最适用于构建真核生物基因文库和cDNA库。
11、 M13噬菌体是一种独特的载体系统,它只能侵袭具有F基因的大肠杆菌,但不裂解寄主菌。
12、M13DNA(RF)在寄主菌内是双链环状分子,象质粒一样自主制复,制备方法同质粒。
13、寄主菌可分泌含单链DNA的M13噬菌体,又能方便地制备单链DNA,用于DNA顺序分析、定点突变和核酸杂交。
14、 ③拷斯(Cos)质粒:是一类带有噬菌体DNA粘性末端顺序的质粒DNA分子。
15、是噬菌体-质粒混合物。
16、此类载体分子容量大,可携带45kb的外源DNA片段。
17、也能象一般质粒一样携带小片段DNA,直接转化寄主菌。
18、这类载体常被用来构建高等生物基因文库。
19、 (3)DNA片段与载体连接:DNA分子与载体分子连接是克隆过程中的重要环节之一,方法有:①粘性末端连接,DNA片段两端的互补碱基顺序称之为粘性末端,用同一种限制性内切酶消化DNA可产生相同的粘性末端。
20、在连接酶的作用下可恢复原样,有些限制性内切酶虽然识别不同顺序,却能产生相同末端。
21、②平头末端连接,用物理方法制备的DNA往往是平头末端,有些酶也可产生平头末端。
22、平头DNA片段可在某些DNA连接酶作用下连接起来,但连接效率不如粘性末端高;③同聚寡核苷酸末端连接。
23、④人工接头分子连接,在平头DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性内切酶识别位点的寡核苷酸片段,经限制性内切酶作用后就会产生粘性末端。
24、 连接反应需注意载体DNA与DNA片段的比率。
25、以λ或Cos质粒为载体时,形成线性多连体DNA分子,载体与DNA片段的比率高些为佳。
26、以质粒为载体时,形成环状分子,比率常为1∶1。
27、 (4)引入寄主细胞:常用两种方法:①转化或转染,方法是将重组质粒DNA或噬菌体DNA(M13)与氯化钙处理过的宿主细胞混合置于冰上,待DNA被吸收后铺在平板培养基上,再根据实验设计使用选择性培养基筛选重组子,通常重组分子的转化效率比非重组DNA低,原因是连接效率不高,有许多DNA分子无转化能力,而且重组后的DNA分子比原载体DNA分子大,转化困难。
28、②转导,病毒类侵染宿主菌的过程称为转导,一般转导的效率比转化高。
29、 (5)克隆的选择: ①直接筛选:有些载体带有可辨认的遗传标记,能有效地将重组分子与本底区分。
30、例如:有些λ噬菌体携带外源基因后形成的噬菌斑就会从原来的混浊变为清亮;还有些载体分子携带外源基因后,形成的菌落或噬菌斑的颜色有明显变化,如蓝色变为无色;有些λ噬菌体能侵染甲菌而不能侵染乙菌,携带外源DNA片段后便能侵染乙菌,因此乙菌释放的噬菌体均为重组分子。
31、 ②间接筛选:有引起载体分子带有一个或多个抗药性标记基因,当外源DNA插入到抗药基因区后,基因失活,抗性消失。
32、如一质粒有A和B两个抗药性基因,当外源基因插入到B基因区后,便只抗A药而不抗B药。
33、因此能在A药培养基上正常生长而不能在B药培养上生长的便是重组分子。
34、 ③核酸杂交:广泛用于筛选含有特异DNA顺序的克隆。
35、方法是将菌落或噬菌斑“印迹”到硝酸纤维膜等支持物上,变性后固定在原位,然后与标记的核酸探针进行杂交。
36、阳性点的位置就是所需要的克隆。
37、 ④免疫学方法:如果重组克隆能在宿主菌中表达,就可以用特异的蛋白质抗体为探针,进行原位杂交,选择特异的克隆。
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